背景：

       在生产O-糖基化生物药物的过程中，由于核心GalNAc残基的不完全加工，可能会出现Tn抗原（GalNAc以α连接的方式链接在丝氨酸/苏氨酸上），有研究指出，Tn抗原可参与C型凝集素巨噬细胞半乳糖凝集素（MGL）结合，且MGL在树突细胞和巨噬细胞中表达，因此Tn抗原与MGL的链接可能引起免疫抑制，帮助肿瘤实现免疫逃逸。

       α-N-乙酰半乳糖苷酶是一种高度特异性的外糖苷酶，可有效水解与糖蛋白（Tn抗原）中丝氨酸或苏氨酸残基连接的α-N-乙酰半乳糖胺（GalNAc），该酶还对α1-3连接的末端GalNAcs显示活性。因此α-N-乙酰半乳糖苷酶可用于去除Tn抗原。

产品包装：

       Rhinogen^® α-N-乙酰半乳糖苷酶包装规格如下：

目录号	规格	浓度
QPF-018-A	2,000U/30μl	67U/μl

配套试剂：

       Rhinogen^®α-N-乙酰半乳糖苷酶提供的试剂如下：

试剂	成分	规格
10×Glyco缓冲液3	200mM Tris， pH 6.8	1ml

       序列来源于Akkermansia muciniphila，重组表达于E. coli，理论分子量约52KD，C端带6×His标签。

产品质量：

       SDS-PAGE分析，纯度≥95%；没有检测到污染的外切糖苷酶、糖苷内切酶及蛋白酶活性。

产品特性：

       α-N-乙酰半乳糖苷酶（α-N-Acetylgalactosaminidase）是一种高度特异性的糖苷外切酶，可有效水解与糖蛋白中丝氨酸或苏氨酸残基连接的α-N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）（Tn抗原），该酶还对α 1-3连接的末端GalNAc显示活性。α-NAGA在天然条件下水解糖蛋白上的GalNAc。适用pH值范围6.0到7.6，不需要辅助因子或特殊缓冲体系。

酶活定义：

       α-N-乙酰半乳糖苷酶能从4-Nitrophenyl N-acetyl-alpha -D-galactosaminide中裂解α-N-乙酰基半乳糖胺基，通过402nm检测释放PNP的量来定义酶活，在所述条件下（20mM Tris，pH6.8）每个活力单位每分钟能释放≥600pmol PNP。

保藏条件：

       1. 采用冰袋运输， 长期储存请置于-20℃，重悬后2-8℃可保存1个月。
       2. 避免反复多次冻融和频繁的温度变化。

应用：

       1.从糖肽及糖蛋白上释放完整的Tn抗原；
       2.对 O-糖基化生物药物进行 Tn 抗原表征；
       3.表征蛋白质是否糖基化及去糖基化；
       4.糖蛋白测序及分析；
       5.糖蛋白重组表达。

特性：

       α-N-乙酰半乳糖苷酶在生理缓冲液和中性pH值中具有活性，使其与大多数样品兼容。此外，α-N-乙酰半乳糖苷酶的活性不依赖于可能损害LC-MS分析的任何辅助因子，例如BSA。根据糖蛋白底物的性质，孵育时间为2~18h。

实验准备：

       使用反应缓冲液中将糖蛋白底物调整至0.5-5.0mg/ml。

糖蛋白消化：

       以2000U/支产品为例：
       1、使用100μl ddH2O重悬冻干粉至20U/μl；
       2、以1U α-N-乙酰半乳糖苷酶/1μg糖蛋白的比例添加α-N-乙酰半乳糖苷酶；
       3 、37℃孵育2-18h。
       注意：根据底物类型适当优化酶的浓度和孵育时间。

注意事项：