介 绍
在制药和医疗器械生产过程中，对污染物样品的监测是一个关键步骤。内毒素存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁中，是一种常见的污染物，可引起发烧、炎症、头痛、恶心，甚至死亡。
内毒素的常规检测方法是鲎试剂溶酶法（LAL），核心成分由鲎的血液中提取而来。在内毒素存在的情况下，LAL 通过酶促级联凝固，可以通过比浊法或显色法定量（图 1 A）。这些方法涉及多个酶的步骤，并受限于鲎资源的多少。
2021 年 2 月 5 日，国家林业和草原局、农业农村部发布公告，调整后的«国家重点保护野生动物名录»正式发布，将我国分布的鲎科动物（中国鲎、圆尾蝎鲎）升级为国家二级保护动物。
中国药典 2020 年版 9251 细菌内毒素检查法应用指导原则中指出，目前新的细菌内毒素检测方法不断出现，以适应特殊品种细菌内毒素检查的需要，或减少鲎试剂的使用量。如重组 C 因子法（见附）、微量凝胶法等。
附：重组C 因子法
C 因子是鲎试剂中对细菌内毒素敏感的蛋白，能够选择性识别内毒素。重组 C 因子是一种人工合成的 C 因子，它被细菌内毒素活化后，可与荧光底物作用产生与内毒素浓度成比例的荧光信号。
本法系依据反应混合物中的内毒素浓度和其孵育终止时的荧光值之间存在量化关系来测定细菌内毒素的含量。本法为终点荧光法。依据检测原理，本法不存在 G 因子旁路干扰，具有较高的专属性，因此适合于含有 β- 葡聚糖干扰的样品检测；本法所用试剂不含有 B 因子和凝固酶原、凝固蛋白原等，因此，含有对上述物质抑制或增强作用的样品适合使用重组 C 因子法。
重组 C 因子法试验需采用荧光酶标仪，其激发和发射波长等参数参照试剂的使用说明书，激发/发射波长一般为 380nm/440nm，检测温度一般为 37°C ±1°C 。
图 1 酶促级联反应 LAL（A）和重组 C 因子 rFC 分析（B）。rFC 分析包括一个一步的酶联反应，消除了对鲎的需要，同时避免葡聚糖引起的 G 因子非特异性干扰造成的假阳性。
图 2 当葡聚糖存在时，LAL 显色法和 rFC 法反应特异性比较。
材料
方 法
① 取用 4 支一次性无热原安瓿瓶，在瓶身标明内毒素工作标准品溶液浓度（分别 0.005、0.05、0.5及5EU/ml），用溶解至 20EU/ml 的内毒素工作标准品溶液制备系列内毒素标准品溶液。
② 提前将微孔板读板机的温度设置为37℃待用。将 100μl 阴性对照（无热原水）、内毒素工作标准品溶液、样品（两组）分别加入到 96 孔无菌无热原白板相应孔中，两复孔。两组样品中分别加入 10μl 0.5EU/ml 的内毒素工作标准品溶液作为加标样品组。加样后的 96 孔板在 37°C ± 1°C 的微孔板读板机中，预热 10-20 分钟。
③ 微孔板预热时，配置底物试剂。按照 5:4:1 的比例混合荧光底物溶液、测定缓冲液和 rFC 酶溶液，轻轻地充分混合，切勿漩涡混合。
④ 设置读板参数：
激发/发射波长设置为 380/440nm，PMT Gain 设置成 Automatic，顶读。以 i3x 为例，酶标仪读板设置如下图所示。
取出预热的 96 孔板，向所有样品孔中加入 100μl/ 孔底物试剂。
读取 0h 的相对应荧光强度 T0，将微孔板继续 37°C ± 1°C 孵育 1h，读取 1h 的相对荧光强度 T1。
⑤ 数据分析：
以内毒素工作标准品溶液浓度为横坐标，净 ΔRFU 为纵坐标绘图并进行 Log-Log 拟合，log(ΔRFU) = A*log(内毒素浓度 EU/ml)+B
说明：
所有孔的 ΔRFU=T1-T0
标准品/样品的净 ΔRFU= 标准品/样品的ΔRFU-阴性对照 ΔRFU
结 果
Molecular Devices 的 4 款微孔板读板机，SpectraMax M2e、SpectraMax M5e、SpectraMax iD3 和 SpectraMax i3x 均符合重组 C 因子试剂盒检测要求。我们已根据Rhinogen® 重组 C 因子内毒素检测试剂盒的说明书编辑了统一的模板，直接调用模板即可读数。
标准曲线以内毒素工作标准品溶液浓度为横坐标，净 ΔRFU 为纵坐标绘图并进行 Log-Log 拟合。标准品有 5 个梯度（0，0.005 EU/ml，0.05 EU/ml，0.5 EU/ml，5EU/ml），每个样品 2 复孔。所有 4 款型号仪器的 R2 值都在 0.998以上，加标回收率也都在中国药典 2020 版要求以内。具体数据如下，
图 3 SpectraMax M2e， 标准曲线 R2 值 0.999
图 4 SpectraMax M5e ，标准曲线 R2 值 0.999，两个样品加标回收率分别为 110% 和 120%
图 5 SpectraMax iD3，标准曲线 R2 值 0.998，两个样品加标回收率分别为 82% 和 98%
图 6 SpectraMax i3x，标准曲线 R2 值 1.000，两个样品加标回收率分别为 102% 和 113%
结 论
Molecular Devices的4款多功能微孔板读板机，SpectraMax M2e、SpectraMax M5e、SpectraMax iD3和SpectraMax i3x均能够进行重组C因子检测，标准曲线展现了完美的线性，SpectraMax i3x R2值达到了1.000。3款仪器样品2复孔CV值小于5%，展现了优异的复孔重现性；加标回收率在82%~113%之间，明显优于中国药典2020版要求50%~200%的范围。
SoftMax Pro 软件可用于分析数据，绘制标准曲线后，自动计算生成 R2和CV值，调用预先设置好的模板可以自动计算出样品的加标回收率并作结果判读。