内毒素
内毒素(即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖分子，lipopolysaccharide，LPS)是研究最透彻也是最常见的生物热原，注射即使是 pg 级别的痕量 LPS 也会导致病人严重的热原反应，引起人体发热、休克甚至死亡。内毒素普遍存在且不易灭活，对制药和医疗器械行业是一个挑战。因此生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类(如一次性注射器，植入性生物材料)都需检测内毒素含量，符合标准的才允许投入市场销售。同时，灵敏可靠的内毒素检测技术也是必须的。随着时代的发展，内毒素检测方法也在不断更新。
上图5种方法中，凝胶法可做定性判断，其他 4 种方法能够进行定量检测，通过标准曲线的绘制，计算出待测样品的内毒素含量。本文介绍的重组 C 因子法，通过内毒素结合并激活的重组 C 因子能够切割底物获得游离的荧光基团，荧光基团的释放与内毒素的浓度呈正比，从而使得内毒素被定量检测。与其他 3 种定量检测方法相比，具有更好的特异性，不受旁路 G 因子的干扰，见下图示意。
2021 年 2 月 5 日，国家林业和草原局、农业农村部发布公告(2021 年第 3 号)，调整后的«国家重点保护野生动物名录»正式发布，将我国分布的鲎科动物(中国鲎、圆尾蝎鲎)升级为国家二级保护动物。随后，3 月 22 日，湛江安度斯发布公告称，由于受国家政策影响，内毒素检测试剂原料将受到严格管控，并表示迫于形势，决定停止供应以下产品：
● 单支凝胶法鲎试剂(0.1mL)- 灵敏度 0.5、0.25、0.125、0.06 EU/mL 将于今年 6 月 30 日停产
● 四次装凝胶法鲎试剂(0.5mL)- 灵敏度 0.25、0.125EU/mL 将于今年 12 月 31 日停产
文中表示，国内药品、医疗器械放行将面临困境，并建议药企、医疗器械企业尽早选择其他替代测试方法。对于经常使用内毒素检测试剂的小伙伴来说，这无疑是一则重磅消息，毕竟在内毒素检测方面，鲎试剂是中国药典通则规定使用的试剂之一，也是其中被应用地最为广泛的一种。
不过，我们可以同样在药典中找到解决之法——重组 C 因子法，该方法目前已被多家全球监管机构所接受，是未来内毒素检测方法的发展方向：
2018 年 9 月 27 日
FDA 已批准 rFC 用于 Eli Lilly 的偏头痛药品 Galcanezumab 的最终产品的细菌内毒素检测及产品放行。
2020 年 6 月
2020 版中国药典《9251 细菌内毒素检查法应用指导原则》提出，可使用重组 C 因子法进行内毒素检查。
2020 年 9 月
USP 新增通则<1085.1>，将重组试剂进行细菌内毒素的检测方法正式收录于《美国药典-国家处方集》(USP-NF)中。
2021 年 1 月 1 日
欧洲药典EP 2.6.32 正式实施。
Rhinogen® 重组 C 因子内毒素检测试剂盒
Rhinogen®重组 C 因子内毒素检测试剂盒是一种不依赖于动物源性成分，灵敏度高、特异性高、可稳定且持续提供的替代鲎试剂的内毒素测定试剂，使用此试剂进行内毒素检测具有相当的优越性：
● 终点荧光测定，与其他定量 LAL 方法相当，同时提高准确性
rFC 法相比鲎试剂动态显色法具有更高的检测准确性
● 灵敏度范围从 0.005 到 5EU/ml，准确性也有所提高
rFC 内毒素检测试剂盒的检测灵敏度高，检测范围为 0.005EU/ml-5EU/ml
● 使用液体试剂，方便简单，并且由重组表达生产，产品批间一致性良好
不同批次的 rFC 内毒素检测试剂盒检测的标准曲线。表明产品具有良好的的批间一致性
● 内毒素特异性检测，无 G 因子旁路干扰 [1]
葡聚糖存在时，LAL 显色法会受到 G因子旁路的干扰，而 rFC 法不受干扰
● 不依赖动物源性成分，符合3R的替代原则，同时提供更高的供应安全性
Rhinogen®重组 C 因子内毒素检测试剂盒可替代传统鲎试剂用于人用和动物用注射药物（如化学药品、放射性药物、抗生素类、生物制品等）及医疗器械(如透析液、植入式器械等)的原辅材料、中间产品、放行产品的内毒素检测。
试剂盒采用终点荧光检测，Molecular Devices 多款荧光/多功能酶标仪都能够满足检测需要，包括：SpectraMax Gemini 系列、SpectraMax M 系列、SpectraMax i 系列、SpectraMax Paradigm。
根据 Rhinogen® 重组 C 因子内毒素检测试剂盒的要求，我们设置了统一的检测模板(如需模板请关注RhinoBio公众号咨询在线客服)。酶标仪温度设置 37℃，分别在 0h 和 1h 进行相对荧光强度检测，读值记作 T0 和 T1。所有孔的 ΔRFU=T1-T0，标准品/样品净 ΔRFU= 标准品/样品 ΔRFU- 阴性对照 ΔRFU。以内毒素工作标准品溶液浓度为横坐标，净 ΔRFU 为纵坐标绘图并进行 Log-Log 拟合，log(ΔRFU) = A*log(内毒素浓度 EU/ml)+B。
本次推送的第二篇文章中详细列举了使用 4 种不同型号的 Molecular Devices 酶标仪进行重组 C 因子法内毒素检测的方法及结果。数据结果表明，不同型号的酶标仪均能够进行重组 C 因子检测，标准曲线展现了优秀的线性，SpectraMax i3x R2 值达到了 1.000。多款仪器样品 2 复孔 CV 值小于 5%，展现了优异的复孔重现性;加标回收率在 82%~113% 之间，明显优于中国药典 2020 版要求 50%~200% 的范围。
同时，Molecular Devices 提供完整的合规解决方案，包括一整套符合 GLP/GMP 要求的仪器硬件确认和企业版软件，能够满足内毒素检测涉及到药物和医疗器械的原辅材料、中间产品、放行产品的检测，数据采集和分析软件及仪器硬件都必须符合相应法规的要求。
企业版软件：
SoftMax® Pro 7.1.2 GxP 是 Molecular Devices 最新、最安全的一款企业版软件，符合全新的 FDA 21 CFR Part 11 的工作流程，以确保您获得数据的完整性。每个步骤都经过优化，其目的是简化分析流程和报告生成时间，以便于支持我们的酶标仪更快获得完整、可靠的数据。
为了确保您的酶标仪符合要求，可通过使用完整的、系统的 IQOQ 服务，Molecular Devices 专业的技术团队会通过耐心、认真的服务迅速协助您建立单机或网络版的合规软件系统，SoftMax Pro 7.1.2 GxP 软件主要在数据隐私和安全性上做了重大改进，使其充分符合新版本 GDPR 规定。
[1]除了不受葡聚糖引起的 G 因子旁路干扰，重组 C 因子内毒素检测与经典的鲎试剂内毒素检测方法一样都会受到检测基质中高盐、强酸强碱、血浆、天然荧光物质等成分的干扰。由于检测的干扰始终是产品特异性的，因此每种产品均应进行正常的干扰验证研究。